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【知识分享】金属污染致峰形异常？液相色谱分析的应对指南

在色谱分析领域，随着技术的不断进步，从手动进样到自动化配置的转变极大地提升了工作效率；从基质到键合相涌现出了各种各样的类别，可谓是形形色色、各有千秋。在这期间，硅胶基质色谱柱因其高机械强度、高柱效和化学稳定性等优势，在小分子分析中占据重要地位。然而，金属污染作为影响色谱分离效果的因素之一，尤其在生物制药兴起后备受关注，但在小分子分析中往往被忽视，但对分离精度和重现性影响显著。本文将围绕金属污染来源、螯合作用机制及消除金属污染的策略三个方面展开探讨。

1

金属污染来源

1.1

硅胶基球

纳谱分析使用母公司纳微科技自主研发的UniSil单分散硅胶微球，纯度一般在99.99%以上，金属含量很低（见图1），金属的影响（见图2和图3）；

image.png

纳谱分析使用的UniSil单分散硅胶微球，采用高纯有机硅烷试剂为原材料制备而成，其金属含量均在5 ppm以下

△ 图1、UniSil单分散硅胶微球金属含量 △

image.png

△ 图2、硅胶晶格中金属的影响 △

image.png

△ 图3、硅胶表面金属的影响 △

1.2

金属柱管和筛板

色谱柱采用的是经特定工艺抛光和钝化处理316L不锈钢柱管及同材质烧结的筛板，尽量减少金属离子的出现，但随着使用，样品或流动相中的一些成分会对柱管和筛板电化学腐蚀，导致金属离子溶出并形成非特异性吸附位点。

1.3

设备中的金属部件

色谱系统中的组件（泵头、管路、进样针等）在反复接触流动相时，也会因电化学腐蚀而持续释放金属离子，形成活性吸附位点。

1.4

其他

流动相或样品前处理中接触到的设备和溶剂，可能迁移出金属离子，形成吸附活性位点。

上述金属污染来源的分析，揭示了色谱系统中，无论是硅胶基质的微量残留、设备中金属配件侵蚀的持续释放，还是流动相或样品对金属柱管和筛板的电化学腐蚀，均可能形成潜在的金属离子库。这些金属离子一旦与目标分析物中富含电子供体（如羧基、氨基或酚羟基）的官能团接触，便会通过螯合作用形成稳定的配位结构。螯合作用不仅改变小分子的电荷分布与空间构型，更会干扰其在固定相上的保留行为，直接表现为峰形拖尾/分叉、保留时间漂移等异常现象。因此， 理解螯合作用的化学本质及其触发条件，是破解金属污染难题、优化分离效能的关键切入点。 接下来，让我们一起了解下螯合作用机制。


2

螯合作用机制

2.1

什么是螯合作用？

螯合作用是一种化学现象，其中某个分子或原子与中心金属离子通过配位键形成环状结构。这种现象通常用于描述金属离子与有机配体之间的相互作用，形成一种稳定的环状结构，称为螯合物。螯合物因其稳定性和结构特殊性，在化学、生物学和医学等领域都有广泛的应用。在生物学和医学领域，螯合作用尤为重要的一个应用是螯合疗法，即使用螯合剂（Chelating agent）来结合并去除人体内的重金属。

2.2

螯合剂有什么特点？

螯合剂通常具有多个可以与金属离子配位的官能团，例如氨基、羧基、醇羟基、硫醇基、芳香环等。这些官能团可以与金属离子形成稳定的配位化合物。

螯合剂中的配位原子以氧和氮为最常见，其次是硫，还有磷、砷等。

以下是一些能与金属发生螯合的常见官能团：

酮（如：酮基）、醇（如：醇基）、羰基（如：酯基、酰基）、胺（如：氨基）、硫（如：硫醇基、硫酸基）、磷（如：磷酸基）、卤素（如：卤素原子）、线性双硫键（如：二硫醚）、亲电芳香官能团（如：吡啶、吡咯、吲哚等）
有一些例子，能够帮助我们更好地理解螯合作用：

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※ 样品中有这些官能团时，需要注意螯合作用引起的色谱图异常，接下来，我们将为您解析：小分子分析中如何消除金属污染的策略。

3

消除金属污染的策略

3.1

从流动相上消除螯合作用力

在高效液相色谱（HPLC）分离技术中，当金属离子对分析物产生配位干扰时，通常建议在流动相体系中，添加特定螯合剂（如：焦磷酸钠、EDTA等），通过选择性的与金属离子形成稳定络合物，从而有效减弱或消除金属污染。
纳谱分析将该策略成功应用于《中国药典》2020版一部蒲公英药材中菊苣酸含量的测定，色谱条件与实验结果如下：

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色谱柱：ChromCore 120 C18, 5μm, 4.6×250mm

仪   器：Waters e2695

流   速：1.0 mL/min 

柱   温：30 ℃

进样量：10 μL

检测器：327 nm

梯度条件一：

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梯度条件二：

A：0.1%甲酸水溶液+5 mM焦磷酸钠（磷酸调节pH=2.6） 

其余条件同梯度条件一

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在这个案例中，我们在流动相中加入一定量的焦磷酸钠，拖尾因子由原来的1.77优化至1.14，峰形更加对称，显著改善了色谱峰形和分离效率。

※ 实际应用中，还可在流动相中加入1-2 mmol的EDTA或磷酸，也能达到相同的效果。

3.2

冲洗设备和色谱柱

使用一段时间后出现拖尾怎么消除？以下是一个真实的技术咨询案例，可供参考。

image.png

4

结论

总之，金属污染在色谱分离中无处不在，主要的解决方式和应对策略：

1、流动相修饰：添加螯合剂（如EDTA、焦磷酸钠）络合游离金属离子；

2、系统维护：定期冲洗色谱柱及流路组件，清除金属残留；

3、色谱柱优化：①金属部件表面镀惰性涂层（如硅碳涂层）阻断金属作用；②采用PEEK等非金属材质柱管，避免离子干扰，显著提升液相色谱分离性能；

4、仪器改进：配置非金属/惰性涂层管线及配件，降低系统金属暴露风险。

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