维生素B₁₂标准储备液：称取维生素B₁₂标准品10.0 mg（精确至0.1 mg），用5%乙醇溶解，并定容至10 mL棕色容量瓶中，混匀，得到维生素B₁₂的标准储备液。冷藏保存。

维生素B₁₂标准中间液：吸取1 mL储备液至25 mL棕色容量瓶中，用水稀释得到维生素B₁₂的标准中间液。冷藏保存。

维生素B₁₂标准溶液系列：分别吸取0.025 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL的标准中间液于10 mL棕色容量瓶中，用水稀释得到维生素B₁₂标准溶液系列。

称取试样2 g，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加入水30 mL，摇晃混匀，超声15分钟，样品恢复至室温后检测样品溶液pH，溶液的pH在7.0以上，用柠檬酸溶液调节pH在4.5~7.0之间，用水定容至50 mL，将溶液转移至50 mL离心管中，以4000 r/min离心5 min，取上清液，即得。

（注：在样品过柱前，可根据实际样品中维生素B₁₂含量进行适当稀释，防止超过免疫亲和柱的柱容量，此产品柱容量是2800 ng）。

SelectCore VB12免疫亲和柱 3mL；

活化：取出免疫亲和柱，恢复至室温（22-25 °C），放干免疫亲和柱的保护液；

上样：取步骤3中制备好的样品待净化液20 mL上样至免疫亲和柱上，流速为1 滴/s，弃去流出液；

淋洗：待样液完全过柱后，用10 mL水以稳定流速淋洗免疫亲和柱，抽干；

洗脱：在免疫亲和柱下放置10 mL玻璃试管，用3 mL甲醇分3次洗脱，收集全部洗脱液，在60 °C下用氮气流缓缓吹至近干，用0.025%三氟乙酸溶液定容至1.0 mL，涡旋30 s溶解残留物，过0.22 μm针式滤器，待测定。

图5、维生素B₁₂标准品、片剂样品、片剂样品加标（加标量：0.917 μg/g）对比图

1.维生素B₁₂

图6、片剂样品过SelectCore VB12免疫亲和柱和片剂样品过SelectCore HLB固相萃取柱对比图

1.维生素B₁₂

目前该保健食品标准提供了两种净化方式：一是N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯亲水亲脂平衡型固相萃取柱（对应纳谱分析的SelectCore HLB固相萃取柱），二是维生素B₁₂免疫亲和净化柱（对应纳谱分析的SelectCore VB12免疫亲和柱）。

针对该片剂样品，我们同时对比了两种净化柱的净化效果，结果如图6中显示，该片剂提取液经SelectCore HLB固相萃取柱净化后，杂质与目标物难以有效分离，无法进行定量计算，而SelectCore VB12免疫亲和柱能够特异性吸附（或富集）维生素B₁₂，高效去除其它干扰成分；故专属性更强、回收率更好（>90%）,能够获得更加稳定可靠的测定结果。

由实验谱图和加标回收率结果可以看出，目标待测物在0.1~8.0 μg/mL的范围内线性良好，r²=0.9999，纳谱分析的SelectCore VB12免疫亲和柱可以有效去除保健食品中基质干扰，结合ChromCore C18色谱柱可以高效分离杂质与维生素B₁₂，并且回收率均在90%以上，能够准确检测目标物含量，满足国标的定量要求。